İnsan Kanser Hücrelerinde Kemoterapötik İlaç Direnç Mekanizmalarının CRISPR/Cas9 Nakavt Kütüphanesi Kullanarak Genom Çapında Belirlenmesi


Öğrenci: ZEYNEP HAZAL YILMAZ

Danışman: Emre Deniz

Kanser, dünya çapında en sık görülen hastalıklar arasındadır. Kanser tedavisi için kemoterapi sırasında sitotoksik ilaçlar yaygın olarak ve genellikle başarıyla kullanılır. Bununla birlikte, özel durumlarda, kanser hücreleri, tedaviden önce veya tedavi sırasında, ilaçların etkinliğini dramatik bir şekilde azaltan direnç geliştirebilir. Bilinen direnç mekanizmalarının birçok gen ürününü inhibe etmeye çalışan çalışmalar ve uygulamalar bilinmektedir, ancak bunlar klinikte yüksek başarı oranlarına ulaşamadı. Bu nedenle, ilaç direnci, kanser terapisi için halen önemli bir sorundur. Bu projenin amacı, kemoterapötik ilaçlara karşı direnç gelişimine katkıda bulunan yeni gen adaylarının belirlenmesidir. Bu amaçla, bu çalışmada İnsan GeCKO v2 Kütüphanesi adı verilen genom çapında bir CRISPR/Cas9 nakavt kütüphanesi kullanılmıştır. Bu kütüphane, 19.052 protein kodlayan ve 1864 miRNA genini nakavt için hedeflemektedir. Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 yapılarını taşıyan lentiviral parçacıklar üretildi ve bir üçlü negative meme kanseri hücre hatt olan MDA-MB-231’ye bir hücreyi en fazla bir viral parçanın enfekte edeceği şekilde aktarıldı. Böylece, her bir hücre, tek bir CRISPR/Cas9 yapısı elde ederek sadece tek bir geni nakavt edecek. Bunları yapmak için ilk önce doksorubisinin MDA-MB-231 hücreleri üzerindeki etkisi MTT ve uzun vadeli koloni oluşumu deneyleri ile belgelendi. Hücreler için doksorubisinin IC50 değeri hesaplandı ve MDA-MB-231 hücrelerinin ilaca direnci değerlendirildi. Kütüphane hücrelere aktarıldıktan sonra, hücreler ardışık olarak ilaçla muamele edildi ve kendilerini toparlamaları için bırakıldı. Genomik DNA'ları izole edildi ve hücre genomuna entegre olmuş olan lentiviral genomun bir kısmı PCR ile çıkarıldı. Bu PCR ürünü, nakledilen genin kimliği hakkında bilgi içeriyor. Bu nedenle, PCR fragmanları yeni nesil amplikon sekanslama için hazırlandı. Sıralama sonuçları, kanser hücrelerinin ilaç direncine katılan olası gen adaylarını belirleyecektir. Yeni tanımlanan bu genler, kliniklerde yeni tanı araçları ve terapiler için kullanılma patansiyeline sahiptir.