Formalinde Fikse Edilmiş Parafine Gömülü Endoskopik Biyopsi Örneğinin MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi ile Peptit Profilinin Analizine Yönelik Örnek Hazırlama Basamaklarının Optimizasyonu


Ergün B., Öktem Okullu S. , Tiftikçi A., İnce Ü. , Özpınar A. , Uçal Y.

3. Ulusal Proteomik Kongresi, İstanbul, Türkiye, 27 - 29 Şubat 2020, ss.37

  • Basıldığı Şehir: İstanbul
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayısı: ss.37

Özet

Amaç:Formalinde fikse edilmiş parafine gömülü (FFPE) dokular, hasta verileri ile ilişkili olarak retrospektif moleküler araştırmalara olanak tanıdıklarından proteomik çalışmalar için değerlidir. Proteomik tekniklerden matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) uçuş zamanı (TOF) kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) yönteminde, kütle spektrometresinden gelen yüksek çözünürlük ve doğruluk ile histolojik bilgi birleştirilmekte olup, analitlerin doku üzerindeki uzamsal dağılımları belirlenmektedir. MALDI-MSI, uzun numune hazırlığına gerek kalmadan doku örneklerini analiz etmek için yüksek kapasiteli olması ve homojenizasyon gerektirmemesinden dolayı diğer proteomik tekniklere göre avantajlıdır. Bu çalışmada, FFPE örneğinin MALDI-MSI ile peptit profilinin analizi için örnek hazırlanmasına yönelik optimizasyon çalışmasının yapılması amaçlanmıştır.

Yöntem:FFPE biyopsi örneğinden MALDI-MSI analizi için mikrotomda 3 ve 5 µm’lik kesitler indiyum kalay oksit (ITO) kaplı lamlara alınmıştır. Dokunun hazırlanması için ksilen ve azalan alkol konsantrasyonlarında yıkama işlemi ve ardından 10 mM Tris-HCl (pH 9) ve 10 mM Sitrat (pH 6) tampon çözeltileri olmak üzere iki farklı antijen geri kazanım prosedürü uygulanmıştır. Proteinlerin peptitlere parçalanması için tripsin enzimi kullanılmış ve sonrasında doku %50 asetonitril ve %0.1 trifluroasetik asit içinde 7 mg/mL α-CHCA ile kaplanmıştır. Dokular, RapifleX MALDI Tissue Typer (Bruker Daltonics) ile analiz edilmiş ve hematoksilen & eozin ile boyanmıştır. Sonuçların değerlendirilmesinde, monoizotopik peptit sayısı, histolojik özelliklerle ilişkili olarak peptit lokalizasyonları ve hiyerarşik kümeleme analizleri (FlexImaging ve ScilSLab (Bruker Daltonics)) kullanılmıştır.

Bulgular:Spektrumda, 5 µm’lik kesitte 3 µm’lik kesite göre daha fazla sayıda monoizotopik peptit tespit edilmiştir. 10 mM Sitrat (pH 6) tampon çözeltisi ise peptit sayısı açısından daha iyi sonuç vermiştir. Ancak; hiyerarşik kümeleme analizine göre iki antijen geri kazanım prosedüründe peptit lokalizasyonlarının doku histolojisi ile korelasyon gösterdiği görülmüştür.

Sonuç:MALDI-MSI, gastrointestinal hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli dokularda peptitlerin lokalizasyonunun belirlenmesini sağlamakta ve moleküler profillerin analizine imkan tanımaktadır. FFPE dokularda formalin fiksasyonundan kaynaklanan metilen çapraz bağlarının ortadan kaldırılması ve dokuların kütle spektrometresi ile analizinde örnek hazırlama basamaklarının optimizasyonu önemlidir.