Hepatoma hücrelerinde floresan etiketli otofaji ve mitofaji genlerinin ifadesi için farklı transfeksiyon ajanlarının değerlendirilmesi


Kan B. , Öz Arslan D. , Durer Z. A.

31. Ulusal Biyofizik Kongresi, Adana, Türkiye, 9 - 12 Ekim 2019, ss.41

  • Basıldığı Şehir: Adana
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.41

Özet

Amaç: Günümüzde floresan etiketli proteinler (FP) ve hücre yapı elemanlarına ve organellerine özgü floresan etiketli antikorlar birçok hücre işlevinin anlaşılmasına olanak sağlamaktadır. Floresan protein-gen füzyon ürünleri memeli ve diğer hücrelere uygun bir vektör (genellikle plazmit ya da virüs) kullanılarak geçici ya da kalıcı olarak aktarılabilir. Gen füzyon ürünleri daha sonra floresan teknolojilerinin kullanıldığı ( floresan mikroskop, akış-sitometri, spektroflorometre gibi)  cihazlar yardımı ile incelenebilir. Bu projedeki amacımız otofaji ve mitofaji gibi hücresel süreçlerde rol oynayan anahtar proteinler için çeşitli florokromları içeren bir plazmit kütüphanesi oluşturmak ve bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonlarını floresan yöntemler kullanarak incelemektir.

Gereç ve Yöntemler: Hepatoma hücreleri (Hep3B) insan Atg3 memeli mEmerald-ATG3-N-18 (Addgene, Plasmid #53999) ve YFP-Parkin (Addgene, Plasmid#23955) ekspresyon plazmitleri ile Lipofektamin 3000 ya da Pei-Max tranfeksiyon ajanları kullanılarak transfekte edildi. Transfeksiyon etkinliği flow-sitometri ve floresan mikroskop kullanılarak izlendi.

Bulgular: Hep3B hücrelerinin Lipofektamin ya da Pei-Max ile transfeksiyonu farklı oranlarda plazmit DNA’sı ve transfeksiyon ajanı kullanılarak optimize edildi. Atg3 plazmidi kullanılarak yapılan transfeksiyonlarda Lipofektamin’in Pei-max transfeksiyon ajanına göre daha etkin olduğu hem flow sitometri hem de floresan mikroskopları kullanılarak gösterildi.

Sonuç: Hepatoma hücrelerine hem Atg3 hem de YFP-Parkin plazmitleri lipofektamin 3000 ile ortalama %70 oranında aktarılmıştır. Florokrom işaretli bu plazmitleri içeren hücrelerde otofaji ve mitofaji düzeylerinin ölçülebilmesi için bir hücre modeli oluşturulmuştur.

Bu çalışma Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu  (ABAPKO, Proje no:2018/03/08) tarafından desteklenmiştir.