ATG3 Proteininin Yeni Etkileşim Partnerlerinin Hep3B Hücrelerinde Araştırılması.


Öz Arslan D. , Açıkgöz D., Kan B. , Öztuğ M., Durer Z. A.

31. Ulusal Biyofizik Kongresi, Adana, Türkiye, 9 - 12 Ekim 2019, ss.29

  • Basıldığı Şehir: Adana
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayısı: ss.29

Özet

Amaç: Hücre içi birikmiş protein kümelerinin, hasar görmüş organellerin yok edilerek geri kazanılması otafaji ile gerçekleşmektedir. Bu süreçte önemli adımlardan biri otofagozom oluşumudur. Otofagozom oluşumunda görev alan proteinler arasında önemli role sahip olan ATG3 proteini içsel düzensiz protein olarak tanımlanmıştır. Gerek yapısal gerek hücresel düzeydeki araştırmalar ATG3 proteinin bilinen otofaji proteinleri dışında farklı proteinlerle etkileşebileceği tezini güçlendirmektedir.  Bu çalışmada, ATG3 aşırı ifade eden hücrelerin otofaji ve mitofajiye indüklenmesinden sonra ATG3 ve etkileşim partnerleri izole edilerek, proteomik ve biyoinformatik yöntemlerle otofaji ve mitofajiye özgü olan partnerlerin saptanması amaçlandı.

Gereç ve Yöntemler: Hep3B hücreleri kültürde büyütüldükten sonra, otofaji aktivatörlerinden Rapamisin ya da Torin 1 ile, ayrıca mitofaji aktivatörü CCCP ile etkileştirildi. İndüksiyonu yapılan hücrelerde otofaji ve mitofajinin gerçekleştiği uygun belirteç antikorları kullanılarak Western emdirim yöntemiyle kontrol edildi. Hücreler daha sonra insan ATG3 memeli mEmerald-ATG3-N-18 (Addgene, Plasmid #53999) ekspresyon plazmidi ile uygun tranfeksiyon ajanları Lipofektamin ya da Pei-Max kullanılarak transfekte edildi. Yeşil floresan protein (YFP)-etiketli proteinler ChromoTek GFP-Trap® agaroz boncuklar kullanılarak çöktürüldü. Kloroform-metanol yöntemiyle temizlenen örnekler, iki boyutlu jel elektroforezi ve LC-MS/MS ile incelendi.

Bulgular: Otofaji ve mitofajinin indüklendiği, LC3B II/I, p62, PARKİN ve PİNK1 protein düzeylerinde doza ve zamana bağlı değişikliklerle gösterildi.  YFP-etiketli ATG3 ile transfekte edilen hücrelerde transfeksiyon etkinliği akış sitometresi ile belirlendi. Çöktürülen YFP-etiketli proteinler iki boyutlu jel elektroforezi ile incelendi. Kontrol ve otofajiye indüklenen hücrelerde ATG3’ün bağlanma partnerleri karşılaştırıldı.

Sonuç: Kullanlan koşulllara bağlı olarak ATG3’ün partnerlerinde nicel olarak farklılık gösteren protein spotları bulunmaktadır.

Bu çalışma TÜBİTAK (No 217Z213) tarafından desteklenmektedir.