Klinik Testlerde İmmünfiksasyon Elektroforez Analizine Alternatif Otomatize Mikropipet Afinite Kromatografi Analiz Yöntemi Geliştirilmesi

Monoklonal gammopatiler (paraproteinemi, disproteinemi), immünolojik olarak monoklonal protein (M proteini, paraprotein) üreten tek bir plazma hücresi klonunun çoğalması ile karakterize edilen bir grup bozukluktur (Goldman and Schafer, 2012; Kyle ve ark., 2013). M-proteinleri polimerler, monomerler, serbest hafif zincirler ile ağır zincirlere ait  immünoglobulin zincirleri veya immünoglobulin fragmanları olabilir (Selvaratnam et al., 2015). Her M proteini, aynı sınıftaki iki ağır polipeptit zincirinden (IgG'de γ, IgA'da α, IgM'de μ, IgD'de δ ve IgE'de ε olarak belirtilen) ve iki hafif zincirden (к veya λ ) oluşur. Monoklonal gammopatiler arasında anlamı bilinmeyen monoklonal gammopati (MGUS), multipl miyelom (MM), smoldering multipl miyelom (SMM), plazma hücre lösemi, sekretuar olmayan miyelom, soliter plazmositom (kemik veya ekstramedüller), POEMS (osteosklerotik miyelom), Waldenström makroglobülinemisi (WM), ağır zincir hastalıkları (HCD) ve primer sistemik amiloidoz (AL) hastalıkları yer alır (Kyle ve ark., 2013). Bu nedenle serum ve idrarda bulunan sağlam immünoglobulinler ve immünoglobulin serbest hafif zincirlerin saptanmasının, bu hastalıkların tanısında, prognozunda ve tedavisinin izlenmesinde önemli bir biyobelirteç olduğu bilinmektedir (Siegel et al., 2009; Davids et al., 2010; Kumar et al., 2019). Ön çalışma sonuçlarımıza göre, serumda M-proteinlerine karşılık gelen monoklonal Ig’lerin bu metodoloji ile tanımlanabileceğini, ölçülebildiğini ve izotiplenebildiğini tespit ettik. IFE’de elde edilen küçük bantların sonuçlarının klinik olarak yorumlamadaki zorluğun aksine kütle tabanlı bu metot ile çok küçük protein konsantrasyonlarında tespit yapılmıştır.  M-proteinleri saptamanın analitik duyarlılığını ve özgüllüğünü geliştirmek için, serum ve idrardaki M-proteinleri ölçmek için kütle spektrometrisi (MS) tabanlı yöntemler mevcuttur (Mills ve ark., 2015; Mills ve ark., 2016; Milani ve ark., 2017). MASS-FIX teknolojisi ile M-protein tespitinin gerçekleştirildiği bu çalışmalardan farklı olarak, bu projede IgG, IgA, IgM, kappa ve lambda selektif rezinlerin minimum miktarları tespit edilip optimize edilmesi ve elde edilecek rezin karışımlarının enkapsüle edileceği mikrotiplerin geliştirilmesiyle ve ayrıştırılan Ig gruplarının tek analizde MALDI-TOF-MS ile analiz edilmesi ve analiz sonucu değerlendirecek uygun algoritmaların geliştirilmesi açısından özgünlük göstermektedir. Bu yöntem, monoklonal Ig'nin korunmuş amino asit sekansına ve dolayısıyla MS kullanılarak yüksek doğruluk ve analitik hassasiyetle ölçülebilen korunmuş bir moleküler kütleye sahip olmasına dayanmaktadır. Bu nedenle, bu yöntem klinik laboratuvarların monoklonal gammopatilerin varlığını tarama ve izleme şeklini değiştirme potansiyeline sahip olduğunu düşünmekteyiz. Hedeflediğimiz metodun başarıya ulaştırılması için, mevcut Ig analizleri yüksek çözünürlük ve hassasiyete sahip MALDI-TOF-MS cihazında gerçekleştirilecektir. Metot optimizasyonu biyolojik kurallara göre yapılması ve validasyon için uluslararası kılavuzların referans alınarak yapılması planlanmıştır. Bu metodun geliştirilmesiyle, mevcut yöntemlerin maliyetini ve süresini ciddi oranda azaltabilecek, doğru, hassas ve güvenilir bir metot geliştirilmiş olacaktır.